飼料凱氏定氮儀

1、準備6個(gè)凱氏燒瓶，標號。1、2、3號燒瓶中分別加入適當濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過(guò)氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對樣品測定進(jìn)行校正。4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其余所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。先用微火加熱煮沸，此時(shí)燒瓶?jì)任镔|(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，務(wù)必注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶?jì)纫后w微沸，至溶液澄清后，再繼續加熱使消化液微沸15min。在消化過(guò)程中要隨時(shí)轉動(dòng)燒瓶，以使內壁粘著(zhù)物質(zhì)均能流入底部，以保證樣品全消化。消化時(shí)放出的氣體內含SO2，具有強烈刺激性，因此自始自終應打開(kāi)抽水泵將氣體抽入自來(lái)水排出。整個(gè)消化過(guò)程均應在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。消化全后，關(guān)閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。

蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內進(jìn)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類(lèi)甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。

儀器安裝前，各部件需經(jīng)一般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗數次，然后安裝并固定在一只鐵架臺上。儀器使用前，微量全部管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可。較長(cháng)時(shí)間未使用的儀器，重復蒸氣洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細檢查各個(gè)連接處，保證不漏氣。 首先在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積蒸餾水，加入數滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結果，并放入少許沸石（或毛細管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經(jīng)插管流入反應室，但玻杯內的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發(fā)生后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開(kāi)關(guān)，使蒸氣只能進(jìn)入反應室，導致反應室內的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應室上端口通過(guò)定氮球進(jìn)入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個(gè)錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發(fā)燙開(kāi)始計時(shí)，連續蒸煮5min，然后移開(kāi)煤氣燈。沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應室內廢液自動(dòng)抽到反應室外殼中，打開(kāi)廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下?lián)Q放一個(gè)盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口浸沒(méi)在溶液中，蒸餾1～2min，觀(guān)察錐形瓶?jì)鹊娜芤菏欠褡兩?。如不變色，表示蒸餾裝置內部已洗干凈。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。

2、無(wú)機氮標準樣品的蒸餾吸收

由于定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù)，初學(xué)者宜先用無(wú)機氮標準樣品進(jìn)行反復練習，再進(jìn)行有機氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標準硫酸銨測試三次。 取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴，蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸沒(méi)在溶液中。注意：在此操作之前必須先打開(kāi)收集器活塞，以免錐形瓶?jì)纫后w倒吸。準確吸取2mL硫酸銨標準液加到玻杯中，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次，一并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿液尚未流入時(shí)，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開(kāi)玻塞，使一半水流入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水封。關(guān)閉收集器活塞，加熱蒸氣發(fā)生器，進(jìn)行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時(shí)起，再蒸餾3～5min，移動(dòng)錐形瓶使瓶?jì)纫好骐x開(kāi)冷凝管下口約lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續蒸餾1min，移開(kāi)錐形瓶，蓋好，準備滴定。 在一次蒸餾完畢后，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管，排除反應完畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。如此反復沖洗干凈后，即可進(jìn)行下一個(gè)樣品的蒸餾。按以上方法用標準硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸餾水代替標準硫酸銨進(jìn)行空白測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。

將消化好的蛋白樣品三支，空白對照液三支，依次作蒸餾吸收。 加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照液中，通過(guò)小玻杯加到反應室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液一并倒入反應室內。其余操作按標準硫酸銨的蒸餾進(jìn)行。 由于消化液內硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶?jì)鹊钩?，必須加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結晶析出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流入反應室。此外，還應當注意趁儀器洗滌尚未冷卻時(shí)立即加入樣品或空白對照液，否則消化液通過(guò)冷卻的管道容易析出結晶，造成堵塞。

樣品和空白蒸餾完畢后，一起進(jìn)行滴定。打開(kāi)接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標準鹽酸溶液進(jìn)行滴定。待滴至瓶?jì)热芤撼拾祷疑珪r(shí)，用蒸餾水將錐形瓶?jì)缺谒闹芰芟匆淮?。若振搖后復現綠色，應再小心滴入標準鹽酸溶液半滴，振搖觀(guān)察瓶?jì)热芤侯伾兓?，暗灰色在一二分鐘內不變，當視為到達滴定終點(diǎn)。若呈粉紅色，表明已超越滴定終點(diǎn)，可在已滴定耗用的標準鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組樣品的定氮終點(diǎn)顏色必須一致?？瞻讓φ找航邮芷?jì)鹊娜芤侯伾蛔兓蚵杂凶兓形闯霈F綠色，可以不滴定。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數，供計算用。